کلونینگ، بیان ژن و خالص سازی کربوکسی پپتیداز جدید از گونه هالوفیل Bacillus persicus دریاچه فوق شور آران و بیدگل

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد بیوشیمی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه گیلان، رشت، ایران

2 دانشیار گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه گیلان، رشت، ایران

3 مربی پژوهشی بانک مولکولی، مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران، جهاد دانشگاهی، تهران، ایران

10.22124/japb.2022.22750.1479

چکیده

پروتئازهای میکروبی به دلیل کاربرد گسترده در صنایع شوینده، دارویی و فرآوری خوراک دام درصد بالایی از کل بازار آنزیم­های صنعتی را به خود اختصاص می­دهند. گونه‌های جنس Bacillus، قابلیت بالایی در تولید و ترشح مقادیر بالای آنزیم­ پروتئاز را دارند که از فعالیت­های فیزیولوژیک آن­ها نشات می­گیرد. در این مطالعه، ابتدا ژن کد کننده کربوکسی پپتیداز از گونه Bacillus persicus به وسیله PCR و با استفاده از آغازگرهای دارای جایگاه‌های برش NdeI و XhoI جدا شد. پس از هضم آنزیمی محصول PCR، قطعه ژن در بین جایگاه‌های مورد نظر در حامل بیانی pET28a+ کلون شد و پلاسمید نوترکیب به داخل سویه بیانی E. coli BL21(DE3) ترانسفورم شد. پلاسمیدهایی که Colony PCR آنها مثبت بود جهت تایید نهایی برای تعیین توالی ارسال شد. بیان آنزیم نوترکیب تحت شرایط دمایی و در زمان‌های مختلف انجام شد و تخلیص پروتئین مورد نظر از طریق کروماتوگرافی تمایلی نیکل آگارز صورت پذیرفت. بیشترین سطح بیان در غلظت 4/0 میلی‌مولار IPTG در دمای 32 درجه سانتی‌گراد و مدت زمان 20 ساعت انکوباسیون تعیین شد. وزن مولکولی پروتئین نوترکیب کربوکسی پپتیداز حدود 58 کیلودالتون بود. با توجه به مقدار بالای بیان پروتئین محلول و بهینه‌سازی آسان بیان و خالص‌سازی آن در شرایط آزمایشگاهی، چنانچه فعالیت آنزیمی در حضور سوبستراهای استاندارد به­ مقدار مناسب باشد و همچنین اگر مطالعات تکمیلی امکان تولید بهینه و به صرفه مقدار بالایی از این آنزیم را در حجم بالا و شرایط نیمه صنعتی نشان دهد، می‌توان امیدوار بود که این آنزیم گزینه مناسبی برای تولید نیمه صنعتی باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


Alizadeh R., Kardani N., Khodakarami A., Khajeh K. and Dabirmanesh B. 2020. Cloning, expression and characterization of carboxypeptidase G2 enzyme from Pseudomonas sp. strain RS-16 in E. coli. Razi Journal of Medical Sciences, 26(10): 8–18.
Alvarez V.M., Von Der Weid I., Seldin L. and Santos A.L.S. 2006. Influence of growth conditions on the production of extracellular proteolytic enzymes in Paenibacillus peoriae NRRL BD‐62 and Paenibacillus polymyxa SCE2. Letters in Applied Microbiology, 43(6): 625–630.
Arahal D.R. and Ventosa A. 2002. Moderately halophilic and halotolerant species of Bacillus and related genera. P: 83–99. In: Berkeley R., Heyndrickx M., Logan N. and De Vos P. (Eds.). Applications and Systematics of Bacillus and Relatives. John Wiley and Sons, USA.
Asker M.M., Mahmoud M.G., El Shebwy K. and Abd el Aziz M.S. 2013. Purification and characterization of two thermostable protease fractions from Bacillus megaterium. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 11(2): 103–109.
Asokan S. and Jayanthi C. 2010. Alkaline protease production by Bacillus licheniformis and Bacillus coagulans. Journal of Cell and Tissue Research, 10: 2119–2123.‏
Bagheri M., Didari M., Amoozegar M.A., Schumann P., Sanchez-Porro C., Mehrshad M. and Ventosa A. 2012. Bacillus iranensis sp. nov., a moderate halophile from a hypersaline lake. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 62: 811–816.
Chaturvedi V., Bhange K., Bhatt R. and Verma P. 2014. Production of kertinases using chicken feathers as substrate by a novel multifunctional strain of Pseudomonas stutzeri and its dehairing application. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 3(2): 167–174.
Chellappan S., Jasmin C., Basheer S.M., Elyas K.K., Bhat S.G. and Chandrasekaran M. 2006. Production, purification and partial characterization of a novel protease from marine Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation. Process Biochemistry, 41(4): 956–961.
Danilova I. and Sharipova M. 2020. The practical potential of Bacilli and their enzymes for industrial production. Frontiers in Microbiology, 11: 1–7 (1782).
De Lourdes Moreno M., Garcia M.T., Ventosa A. and Mellado E. 2009. Characterization of Salicola sp. IC10, a lipase-and protease-producing extreme halophile. FEMS Microbiology Ecology, 68(1): 59–71.
Didari M., Amoozegar M.A., Bagheri M., Mehrshad M., Schumann P., Sproer C., Sanchez-Porro C. and Ventosa A. 2013. Bacillus persicus sp. nov., a halophilic bacterium from a hypersaline lake. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 63: 1229–1234.‏
Dodia M.S., Rawal C.M., Bhimani H.G., Joshi R.H., Khare S.K., and Singh S.P. 2008. Purification and stability characteristics of an alkaline serine protease from a newly isolated Haloalkaliphilic bacterium sp. AH-6. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 35(2): 121–131.
Garcia-Guerrero M.C., Garcia-Pardo J., Berenguer E., Fernandez-Alvarez R., Barfi G.B., Lyons P.J., Aviles F.X., Huber R., Lorenzo J. and Reverter D. 2018. Crystal structure and mechanism of human carboxypeptidase O: Insights into its specific activity for acidic residues. Proceedings of the National Academy of Sciences, 115(17): 3932–3939.‏
George N., Chauhan P.S., Kumar V., Puri N. and Gupta N. 2014. Approach to ecofriendly leather: Characterization and application of an alkaline protease for chemical free dehairing of skins and hides at pilot scale. Journal of Cleaner Production, 79: 249–257.‏
Germano S., Pandey A., Osaku C.A., Rocha S.N. and Soccol C.R. 2003. Characterization and stability of proteases from Penicillium sp. produced by solid-state fermentation. Enzyme and Microbial Technology, 32(2): 246–251.
Ghafoor A. and Hasnain S. 2010. Purification and characterization of an extracellular protease from Bacillus subtilis EAG-2 strain isolated from ornamental plant nursery. Polish Journal of Microbiology, 59(2): 107–112‏.
Ghafoori H., Askari M. and Sarikhan S. 2016. Purification and characterization of an extracellular haloalkaline serine protease from the moderately halophilic bacterium, Bacillus iranensis (X5B). Extremophiles, 20(2): 115–123.
Gomes J. and Steiner W. 2004. The biocatalytic potential of extremophiles and extremozymes. Food Technology and Biotechnology, 42(4): 223–225.
Gomis-Ruth F.X., Companys V., Qian Y., Fricker L.D., Vendrell J., Aviles F.X. and Coll M. 1999. Crystal structure of avian carboxypeptidase D domain II: A prototype for the regulatory metallocarboxypeptidase subfamily. The EMBO Journal, 18(21): 5817–5826.‏
Jankiewicz U. and Bielawski W. 2003. The properties and functions of bacterial aminopeptidases. Acta Microbiologica Polonica, 52(3): 217–231.‏
Makhdoumi-Kakhki A., Amoozegar M.A., Kazemi B., Pasic L. and Ventosa A. 2009. Prokaryotic diversity in Aran-Bidgol salt lake, the largest hypersaline playa in Iran. Microbes and Environments, 27(1): 87– 93.‏
Mansur M., Martinez L., Perez M., Alonso-del-Rivero M., Marquez I., Proenza Y., Varas L. and Aviles F.X. 2007. Expression, purification and characterization of porcine pancreatic carboxypeptidase B from Pichia pastoris for the conversion of recombinant human insulin. Enzyme and Microbial Technology, 40(3): 476–480.‏
Purohit M.K., Raval V.H. and Singh S.P. 2014. Haloalkaliphilic bacteria: Molecular diversity and biotechnological applications. P: 61–79. In: Parmar N. and Singh A. (Eds.). Geomicrobiology and Biogeochemistry, Soil Biology, Vol. 39. Springer, Germany.
Setati M.E. 2010. Diversity and industrial potential of hydrolase producing halophilic/halotolerant eubacteria. African Journal of Biotechnology, 9(11): 1555–1560.
Song P., Xu W., Zhang Y., Wang F., Zhou X., Shi H. and Feng W. 2021. A new carboxypeptidase from Aspergillus niger with good thermostability, pH stability and broad substrate specificity. Scientific Reports, 11(1): 1–10.‏
Sun T., Xiao W., Jiang C., Wang J. and Liu Z. 2019. Producing amino acid fertilizer by hydrolysis of the fermented mash of food waste with the synergy of three proteases expressed by engineered Candida utilis. Bioresource Technology Reports, 7: 1–8 (100268).
Su-Xia L., Yu-Jian Z.H.A.N.G., Li-Ping T.I.A.N., Qin-Sheng Y.U.A.N. and Yi G.O.N.G. 2003. Cloning and expression of a new rat procarboxypeptidase B gene in Escherichia coli and purification of recombination carboxypeptidase B. Protein and Peptide Letters, 10(6): 581–590.‏
Tahirou T., Zhou J., Rao Z., Huang G., Yang T., Zhang X., and Xu M. 2016. Cloning, over-expression, and characterization of a new carboxypeptidase A gene of Bacillus pumilus ML413 in Bacillus subtilis 168. African Journal of Biotechnology, 15(17): 684–695.‏