طراحی و ساخت سازه ژنی برای تولید ماهی گورخری تراریخت Tg(pdx1:GFP) به عنوان مدلی برای مطالعات دارویی در دیابت

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد ژنتیک، گروه زیست‌شناسی سلولی و مولکولی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، کرج، ایران

2 دکتری ژنتیک آبزیان، گروه سلول‌های بنیادی و زیست‌شناسی تکوینی، پژوهشکده زیست‌شناسی و فناوری سلول‌های بنیادی، پژوهشگاه رویان، سازمان جهاد دانشگاهی، تهران، ایران

3 دانشیار گروه زیست‌شناسی سلولی و مولکولی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، کرج، ایران

4 دانشیار گروه سلول‌های بنیادی و زیست‌شناسی تکوینی، پژوهشکده زیست‌شناسی و فناوری سلول‌های بنیادی، پژوهشگاه رویان، سازمان جهاد دانشگاهی، تهران، ایران

10.22124/japb.2024.28064.1549

چکیده

ژن pdx1 که با نام فاکتور انسولین 1 هم شناخته می­شود کلید اصلی رشد و تکوین پانکراس و همچنین بلوغ سلول­های بتا و بقای آنها است. با هدف قرار دادن این ژن، مدل­های تراریخت مختلفی در سلول­های بنیادی و همچنین مدل­های جانوری تولید شده‌اند که در زمینه پژوهش‌های بیماری دیابت کاربرد دارند. در این پژوهش، هدف ساخت پلاسمید ژنی بر پایه Tol2 با استفاده از روش کلون‌سازی مرسوم است که برای ایجاد مدل تراریخت ماهی گورخری Tg(pdx1:GFP) قابل استفاده است. برای نشاندار کردن این ژن نیاز است بخشی از توالی پروموتر آن در بالادست ژن گزارشگر قرار گیرد. از آنجایی که ناحیه تنظیمی ژن pdx1 تعریف نشده است، دو جفت آغازگر را برای تقویت توالی ʹ5 طرفین 2500 و 6600 جفت باز در بالادست کدون شروع ATG در ژن pdx1 ماهی گورخری طراحی شد که به انتهای ʹ۵ وʹ3 هر کدام از این آغازگرها توالی آنزیم­های محدود کننده انتخاب شده­ای (SalI و Sph1) قرار داده شد. بدین منظور بعد از طراحی آغازگرهای مناسب برای دو طول متفاوت از توالی پروموتور ژن pdx1 بیان شونده در مسیر سلول‌های بتا، این قطعات تکثیر و با استفاده از روش کلون‌سازی مرسوم، بعد از هضم آنزیمی و با استفاده از واکنش اتصال، در پلاسمید Tol2 حاوی ژن گزارشگر فلورسنت سبز وارد شدند. تایید صحت فرایند کلون‌سازی با استفاده از کلونی PCR، هضم آنزیمی و توالی‌یابی انجام شد. نتایج نشان داد که فرایند کلون‌سازی مرسوم علاوه بر هزینه کم برای کلون کردن قطعات با اندازه­های مختلف دارای کارایی مناسب است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


Ausubel F.M. 1992. Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, USA. 804P. doi: 10.1002/abio.370130118
Brown T.A. 2020. Gene cloning and DNA analysis: An introduction. John Wiley and Sons, UK. 432P.
Chawla P., Silva L.F.D. and Ninov N. 2020. Insights on β-cell regeneration from the zebrafish shoal: From generation of cells to functional integration. Current Opinion in Physiology, 14: 27–34. doi: 10.1016/j.cophys.2019.11.009
Choi T.Y., Choi T.I., Lee Y.R., Choe S.K. and Kim C.H. 2021. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Experimental and Molecular Medicine, 53(3): 310–317. doi: 10.1038/s12276-021-0 0571-5
Devlin R.H., Biagi C.A., Yesaki T.Y., Smailus D.E. and Byatt J.C. 2001. Growth of domesticated transgenic fish. Nature, 409(6822): 781–782. doi: 10.1038/35057314
Djurkin Kusec I., Radisic Z., Komlenic M. and Kusec G. 2015. Comparison of commercial DNA kits and traditional DNA extraction procedure in PCR detection of pork in dry/fermented sausages. Poljoprivreda, 21(1): 199–202. doi: 10.18047/poljo.21.1.sup.47
Green M.R. and Sambrook J. 2020. Cloning in plasmid vectors: Directional cloning. Cold Spring Harbor Protocols, 2020(11): 485–488. doi: 10.1101/pdb.prot101238
Helker C.S.M., Mullapudi S.T., Mueller L.M., Preussner J., Tunaru S., Skog O., Kwon H.B., Kreuder F., Lancman J.J., Bonnavion R., Dong P.D.S., Looso M., Offermanns S., Korsgren O., Spagnoli F.M. and Stainier D.Y.R. 2019. A whole organism small molecule screen identifies novel regulators of pancreatic endocrine development. Development, 146(14): 1–12 (dev172569). doi: 10.1242/dev.1725 69
Huang H., Vogel S. S., Liu N., Melton D. A. and Lin S. 2001. Analysis of pancreatic development in living transgenic zebrafish embryos. Molecular and Cellular Endocrinology, 177(1-2): 117–124. doi: 10.1016/s0303-7207 (01)00408-7
Karami F., Asgari Abibeiglou B., Pahlavanneshan S., Farrokhi A., Tamadon A., Basiri M., Khalooghi K., Fallahi M. and Tahamtani Y. 2022. Enhanced characterization of beta cell mass in a Tg (Pdx1-GFP) mouse model. BioImpacts: 12(5): 463–470. doi: 10.34172/bi.2022.23840
Kaufman D. and Evans G. 1990. Restriction endonuclease cleavage at the termini of PCR products. BioTechniques, 9(3): 304–306.
Kawakami K., Shima A. and Kawakami N. 2000. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences, 97(21): 11403–11408. doi: 10.1073/ pnas.97.21.11403
Kawakami K., Takeda H., Kawakami N., Kobayashi M., Matsuda N. and Mishina M. 2004. A transposon-mediated gene trap approach identifies develop-mentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell, 7(1): 133–144. doi: 10.1016/j.devcel. 2004.06.005
Kimmel R.A., Dobler S., Schmitner N., Walsen T., Freudenblum J., and Meyer D. 2015. Diabetic pdx1-mutant zebrafish show conserved responses to nutrient overload and anti-glycemic treatment. Scientific Reports, 5(1): 1–14 (14241). doi: 10.1038/srep142 41
Kimmel R.A., Onder L., Wilfinger A., Ellertsdottir E. and Meyer D. 2011. Requirement for Pdx1 in specification of latent endocrine progenitors in zebrafish. BMC Biology, 9(1): 1–15. doi: 10.1186/17 41-7007-9-75
Lavergne A., Tarifeno-Saldivia E.J., Pirson J., Reuter A.S., Flasse L., Manfroid I., Voz M.L. and Peers B. 2020. Pancreatic and intestinal endocrine cells in zebrafish share common transcriptomic signatures and regulatory programmes. BMC Biology, 18: 1–19. doi: 10.1186/s12 915-020-00840-1
Lee Y., Choi H.Y., Kwon A., Park H., Park M.H., Kim J.W., Kim M.J., Kim Y.O., Kwak S. and Koo S.K. 2019. Generation of a PDX1-EGFP reporter human induced pluripotent stem cell line, KSCBi005-A-3, using the CRISPR/Cas9 system. Stem Cell Research, 41: 1–4 (101632). doi: 10.1016/j.scr.2019.101632
Liu C.J., Jiang H., Wu L., Zhu L.Y., Meng E. and Zhang D.Y. 2017. OEPR cloning: An efficient and seamless cloning strategy for large-and multi-fragments. Scientific Reports, 7(1): 1–7. doi: 10.1038/srep 44648
Liu K.C., Villasenor A., Bertuzzi M., Schmitner N., Radros N., Rautio L., Mattonet K., Matsuoka R.L., Reischauer S., Stainier D.Y. and Andersso O. 2021. Insulin-producing β-cells regenerate ectopically from a mesodermal origin under the perturbation of hemato-endothelial specification. eLife, 10: 1–23 (65758). doi: 10.7554/eLife.65758
Mi J., Liu K.C. and Andersson O. 2023. Decoding pancreatic endocrine cell differentiation and β cell regeneration in zebrafish. Science Advances, 9(33): 1–23 (eadf5142). doi: 10.1126/sciadv.adf5 142
Mohseni A., Majidzadeh K. and Soleimani M. 2012. A new screening method for selection of desired recombinant plasmids in molecular cloning. African Journal of Biotechnology, 11(64): 12777–12780. doi: 10.5897/AJB11.3185
Nora L.C., Westmann C.A., Martins‐Santana L., Alves L.D.F., Monteiro L.M.O., Guazzaroni M.E. and Silva‐Rocha R. 2019. The art of vector engineering: Towards the construction of next‐generation genetic tools. Microbial Biotechnology, 12(1): 125–147. doi: 10.1111/1751-7915.13318
Pourghadamyari H., Rezaei M., Basiri M., Tahamtani Y., Asgari B., Hassani S.N., Meshkani R., Golmohammadi T. and Baharvand H. 2019. Generation of a transgenic zebrafish model for pancreatic beta cell regeneration. Galen Medical Journal, 8: 1–8 (e1056). doi: 10.31661/gmj.v8i0.1056
Salehpour A., Rezaei M., Khoradmehr A., Tahamtani Y. and Tamadon A. 2021. Which hyperglycemic model of zebrafish (Danio rerio) suites my type 2 diabetes mellitus research? A scoring system for available methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 9: 1–15 (652061). doi: 10.3389/fcell.2021.65 2061
Scharf S.J., Horn G.T., and Erlich H.A. 1986. Direct cloning and sequence analysis of enzymatically amplified genomic sequences. Science, 233(4768): 1076–1078. doi: 10.1126/science.3461561
Subramanian S. 2021. Zebrafish as a model organism- Can a fish mimic human? Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology, 34(5): 559–575. doi: 10.1515/jbcpp-2021-0113
Wu R. 2012. Recombinant DNA Methodology II. Academic Press, USA. 904P. doi: 10.1016/C2009-0-0 2410-6
Zang L., Maddison L.A. and Chen W. 2018. Zebrafish as a model for obesity and diabetes. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 6: 1–31 (91). doi: 10.3389/fcell.2018. 00091